主要技术内容
5 冷冻成纤维细胞
5.1 供体数量
5.1.1 系谱清晰的种群，保存的成纤维细胞应覆盖所有家系。每个家系公羊不少于5只，母羊不少于6只；不足时全部保存。
5.1.2 系谱不清的种群，保存不少于10只公羊和30只母羊的成纤维细胞；不足时全部保存。
5.2 成纤维细胞提取及冷冻保存
5.2.1 按NY/T 1900执行。
5.2.2 采耳组织前依次用碘伏及75% 酒精对拟采区消毒脱碘，以灭菌耳钳剪取组织，置入含5 mL 1%双抗PBS的无菌管中，冰袋低温暂存并运送至实验室。
5.2.3 取出组织用碘伏速擦（避免久触切口）并75% 酒精脱碘，经75%酒精再消毒后剃净毛发；随后依次浸入75%酒精30 s、含双抗PBS 30 s漂洗。将组织在含双抗PBS中充分剪碎，1000 r/min离心3 min，弃上清后重悬，同条件洗涤3次。随后加6 mL 0.1%胶原酶IV消化液重悬，37℃横置消化约75 min（每5 min轻摇），至液体混浊拉丝时终止。加等体积完全培养基终止消化，过滤去除未消化团块，滤液1100 r/min离心3 min；弃上清，以1 mL完全培养基重悬沉淀入培养瓶，补液至5 mL摇匀，37℃培养，24 h观察贴壁及污染，48 h换液。
5.2.4 取对数生长期且汇合度达70-80%的细胞进行传代。弃培养基，PBS润洗去除残余血清及代谢物，弃液后加500 μL胰蛋白酶，37℃消化1.5-2 min至细胞变圆缩，加2 mL完全培养基终止消化。吹打收集细胞，1300 rpm离心3 min获沉淀，加1 mL完全培养基重悬细胞，吸取30 μL细胞悬液使用Countstar自动细胞计数仪进行细胞计数，获得细胞悬液的浓度计算总细胞量。
5.2.5 按C1V1=C2V2计算，将细胞浓度调整至1.0×10⁶个/mL以上。再次1300 rpm离心3 min，弃上清，加计算体积的冻存液重悬，按1 mL/管分装至1.8 mL冻存管。标记耳标、性别、代次、管号及日期，转入-80℃冰箱保存。一周后转入液氮长期保存。
5.3 质量要求
5.3.1 细胞制备与质量应符合 NY/T1900 的规定。
5.3.2 每个个体细胞培养至2～4代，冷冻5管，细胞密度为1×105个/mL～5×105个/mL。
5.3.3 冻存后细胞活力（台盼蓝染色排除法）不低于80%，生长曲线与冻前基本一致，核型正常，且无病原菌与支原体污染。
5.4 标识与记录
5.4.1冻存管应标注供体单位、品种、样品编号、家系、性别、培养代次及冻存日期。
5.4.2 应记录成纤维细胞冷冻信息，记录表式样见附录1。
5.5 品质检测
按GB/T24862执行。
6 冷冻精液
6.1 供体数量
6.1.1 系谱清晰的种群，每个家系应保存不少于3只公羊的精液；不足3只时，全部保存。所保存的精液应涵盖所有家系。
6.1.2 系谱不清的种群，宜保存不少于10只公羊的精液；不足10只时，全部保存。
6.2 精液采集及冷冻保存
6.2.1 按NY/T 3186执行。
6.2.2 采精人员蹲伏母羊右侧，持假阴道呈35-40°角，待公羊爬跨时将阴茎导入假阴道；射精后顺势后移取下，集精杯端朝下，记录射精量并质检。每采完一只需清洗假阴道内筒并更换离心管。初评颜色、体积与密度后，镜检精子活力，将活力大于80%的精液用于冷冻保存。
6.2.3 精液采用两步等温稀释法：先用冷冻稀释液Ⅰ液进行10倍稀释，轻柔吹打混匀；再加入等体积的冷冻稀释液Ⅱ液，轻柔混匀，最终将原精稀释20倍。随后，将稀释精液分装至0.25 mL细管中并用封口膜封口，置于4℃冰箱（铺垫8层纱布）降温平衡0.5~2 h。平衡后将细管平铺于熏蒸架上进行程序冷冻，经-10℃、-100℃降至-140℃后投入液氮，装入纱布袋长期保存于液氮罐中。
6.3 质量要求
应符合GB 20557-2025规定。
6.4 标识与记录
6.4.1细管上应标明供体单位、品种、个体编号、家系及生产日期。
6.4.2 应详细记录公羊精液冷冻信息，记录表式样见附录2。
6.5 品质检测
按GB 20557-2025执行。
7 冷冻卵母细胞
7.1 数量要求
7.1.1 系谱清晰的种群，每个品种应保存不少于30只母羊的卵母细胞，每个个体不少于20枚。
7.1.2 系谱不清的种群，宜保存不少于20只母羊的卵母细胞。
7.2 卵母细胞收集及冷冻保存方法
7.2.1 术前准备需无菌环境（手术间紫外灯消毒30 min，操作台及保定架用75%酒精擦拭，全程无菌操作）。供体母羊术前禁食16 h、禁水8 h；仰面头低45°固定于手术架，拉出舌头防窒息；刮净下腹部乳房区羊毛，注射陆眠宁（0.1 mL）诱导并辅以吸入式呼吸麻醉，术部碘伏消毒、酒精脱碘并铺创巾。
7.2.2 冲卵时，于乳房基部与腹股沟连接中点开2-3 cm小口，置入无创伤抓钳和腹腔镜；镜下依次定位膀胱、子宫与卵巢。随后将子宫角与输卵管伞部引出腹腔外，分别插入套管针与引流管，用20 mL注射器吸取冲卵液从套管针向输卵管伞部方向冲洗，以50 mL离心管接取5-10 mL冲卵液。冲卵液于38.5℃保温带回实验室进行捡卵、分级、冷冻与记录。术后注射陆眠灵（0.2 mL）及青、链霉素各一支，腹腔灌入林可霉素稀释液100-200 mL防粘连，最后缝合伤口并碘伏消毒。
7.2.3 采用玻璃化冷冻方法，首先将收集的成熟卵母细胞转至基础液（含有20% FBS的M199）中孵育3 min，然后转入预处理液（含7.5% EG和7.5% DMSO的基础液）中平衡5 min，最后转入玻璃化冷冻液（含15% EG、15% DMSO和0.5 M海藻糖的基础液）中平衡30 s并装载在Cryotop上，标注清晰后立即投入液氮，时间控制在1 min内。
7.3 冻存形式
使用cryotop载杆进行玻璃化冷冻，每个载杆不超过5枚卵母细胞。
7.4 质量要求
卵母细胞解冻后应达到A级或B级。
包含第一极体、胞质均匀，透明带完整，卵周间隙与透明带比例适中（1:1）的评定为A级；包含第一极体，胞质略微不均匀，胞质颗粒明显，透明带完整的评定为B级。
7.5 标识与记录
7.5.1细管上应注明供体单位、品种、母羊号、冷冻方法、数量及冻存日期。
7.5.2 应记录卵母细胞冷冻信息，记录表式样见附录3。
8 冷冻胚胎
8.1 供体数量
8.1.1 系谱清晰的种群，用于胚胎采集的母羊及配种公羊应覆盖所有家系。每个家系参与配种的公羊不少于5只（不足则全部参与），母羊不少于6只（不足6只不建议制作冷冻胚胎）。
8.1.2 系谱不清的种群，宜保存不少于25只母羊的胚胎，其中配种公羊数宜不少于10只。若群体母羊数低于50只，可采集淘汰母羊胚胎保存。
8.2 胚胎收集及冷冻保存方法
8.2.1 胚胎冷冻按NY/T 1900执行。
8.2.2 手术操作参照7.2.2。
8.2.3 冲胚时，于乳房基部与腹股沟连接中点开2-3 cm小口，置入无创伤抓钳和腹腔镜；镜下依次定位膀胱、子宫与卵巢。随后将子宫角与输卵管伞部引出腹腔外，分别插入套管针与引流管，用20 mL注射器吸取冲胚液从套管针向输卵管伞部方向冲洗，以50 mL离心管接取5-10 mL冲胚液。冲胚液于38.5℃保温带回实验室进行捡胚、分级、冷冻与记录。
8.2.4 将胚胎转入预处理液（含10% EG的mPBS）中平衡5 min，依次按照蔗糖溶液（5 cm）—空气（1 cm）—玻璃化冷冻液（0.5 cm）—空气（0.5 cm）—玻璃化冷冻液+胚胎（1.5 cm）—空气（0.5 cm）—玻璃化冷冻液（0.5 cm）—空气（1 cm）—蔗糖溶液（1 cm）进行装管。玻璃化冷冻液为含40% EG、0.5 M海藻糖和18%聚蔗糖（w/v）的mPBS溶液，胚胎自移入细管内玻璃化冷冻液至投入液氮时间为30 s。
8.3质量要求
8.3.1胚胎采集时间为首次配种后第6-7天，阶段为桑椹胚或囊胚。
8.3.2 冷冻前胚胎质量应达到A级，检测方法参照 NY/T1674。
8.4 标识与记录
8.4.1胚胎冻存细管应标注供体单位、品种、母羊号、公羊号、胚胎发育阶段、等级、冷冻方法、数量及冻存日期。
8.4.2 应记录胚胎冷冻信息，记录表式样见附录4。
9 入库保存
所有冷冻遗传材料（成纤维细胞、精液、卵母细胞、胚胎）须符合本文件质量要求，方可放入遗传资源保存库进行长期保存，同步建立完善的库内登记档案。
10 档案管理
所有相关档案记录应永久保存。
适用范围
本文件规定了山羊成纤维细胞、精液、卵母细胞和胚胎等遗传材料冷冻保存的基本要求、技术流程、质量指标、储存条件及档案管理要求。
本文件适用于山羊遗传材料的冷冻保存操作与管理。
是否包含专利
否
