主要技术内容
(一)范围
本文件规定了西红花球茎中吲哚乙酸和吲哚丁酸的液相色谱-串联质谱测定方法。
本文件适用于西红花球茎中吲哚乙酸和吲哚丁酸的测定。
(二) 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682 分析实验室用水规格和试验方法
GB/T 27404 实验室质量控制规范 食品理化检测
(三) 原理
试样用酸化乙腈提取，经固相萃取柱净化后供液相色谱-串联质谱仪测定，外标法定量。
(四)试剂、标准品及材料
除另有说明外，水为GB/T 6682规定的一级水。乙腈（CH3CN，75-05-8）：色谱纯；甲醇（CH3OH，67-56-1）: 色谱纯；甲酸（HCOOH）：色谱纯，纯度≥98%；氯化钠(NaCl,CAS号:7647-14-5)；优级纯1%甲酸-乙腈溶液:吸取1mL甲酸，用乙腈定容至100mL。0.1%甲酸-甲醇溶液：取0.5mL 甲酸用甲醇定容至500mL。
标准品信息:吲哚乙酸标准物质（C10H9NO2）：CAS号 87-51-4，纯度≥98%。吲哚丁酸标准物质（C12H13NO2）：CAS号 133-32-4，纯度≥98%。吲哚乙酸、吲哚丁酸标准储备液：100.0μg/mL。准确称取适量（精确至0.1mg）的吲哚乙酸、吲哚丁酸标准物质，分别用少量甲醇溶解并转移至 100 mL 容量瓶中，分别用甲醇定容至刻度，混匀，-18 ℃以下避光保存 6 个月。混合标准储备溶液：分别从标准储备溶液准确移取上述吲哚乙酸、吲哚丁酸标准储备液 1.0 mL 至 100 mL 容量瓶中，用甲醇定容至刻度，混匀，浓度为 1.0 μg/mL，0～4 ℃以下避光保存。混合标准工作溶液：根据需要用甲醇稀释配制成浓度为 3.0 g/L、5.0 g/L、10.0 g/L、20.0 g/L、50.0 g/L、100.0 g/L、300.0 g/L的标准工作溶液。混合标准工作溶液应现用现配。
材料信息:HLB 固相萃取柱（N-乙烯基吡咯烷酮-二乙烯基苯）：填料200mg，规格6mL，使用前用 5 mL 甲醇和 5 mL 水预处理。滤膜：0.22 μm，有机相。离心管。
（五）仪器设备
液相色谱-串联质谱：配备电喷雾离子源（ESI）。离心机：4000 r/min。超声波清洗器：100 kHz。分析天平：感量0.1mg。均质机。涡旋混合仪。
（六）样品
取有代表性的试样100克，装入干净的容器内匀浆混匀，放入聚乙烯瓶中。将试样按照测试与备用分别存放，于-18℃保存。在抽样及制样的操作过程中，应防止样品受到污染或待测物发生含量的变化。（七）试验步骤
提取：准确称取5g试样（精确至0.1 mg）于50 mL离心管中，用10 mL1%甲酸-乙腈溶液分两次提取，每次5 mL，涡旋混匀，超声提取10 min后，4000 r/min速度离心5 min，合并上清液。在上清液中加入8g氯化钠，涡旋混匀，4000 r/min速度离心5 min，准确吸取5mL上清液，用水定容至50mL。
净化：将稀释后的上清液全部过柱，通过后，用5 mL水洗涤，弃去淋洗液，负压抽干，用5 mL0.1%甲酸-甲醇洗脱。上样、淋洗、洗脱过程，流速均不超过2滴/秒,经微孔滤膜过滤，供液相色谱-串联质谱测定。
空白试验：除不加试样外，按照样品处理步骤进行空白试验。
测定：液相色谱参考条件：色谱柱：BEH C18，1.7μm， 5 cm×0.21 cm（内径）或相当者；柱温：35℃；流动相：5mmol/L乙酸胺0.1%甲酸水溶液+乙腈（体积比7:3）；流速：0.3mL/min；进样量：3μL。
质谱参考条件：离子源类型：ESI；扫描方式：正离子扫描、接口温度：300℃；雾化气流量：3 L/min；加热气流量：10 L/min；脱溶剂管温度：250℃；加热块温度：400℃；干燥气流量：10 L/min；
检测方式：多反应监测MRM，多反应监测条件见表1
化合物名称 保留时间
min 扫描模式 母离子
m/z 子离子
m/z 碰撞电压
V
IAA 1.41 ESI+ 176.1 130.1* 19
77.1 43
IBA 3.60 ESI+ 204.2 186.1* 13
130.2 23
定性分析：按照上述条件测定样品和混合标准溶液，如果样品中检出的色谱峰保留时间与所用标准溶液中目标物的保留时间一致，并且在扣除背景后所选择的2对离子的丰度与标准溶液中目标物的2对子离子丰度比的偏差不超过表2的限定，则可判定样品中存在相应的目标物。
表2 定性测定是相对离子丰度的最大允许偏差 单位为百分率
类别 范围
相对离子丰度 ＞50 ＞20-50 ＞10-20 ≤10
允许的相对偏差 ±20 ±25 ±30 ±50
定量测定：采用外标法进行定量计算。按浓度由小到大的顺序，依次分析所用混合工作标准溶液，得到浓度与定量离子峰面积的工作曲线。样品溶液中分析物的响应值应在工作曲线范围内。超过线性范围时，应根据测定浓度将试样溶液进行适当倍数稀释,再进行分析。
注：本方法所测定的基质为西红花球茎，吲哚乙酸为内源性植物生长激素，样品内含有不定量吲哚乙酸，所以本法未采用基质标曲定量，采用的是溶剂标曲。
（八）结果计算
试样中被测组分含量按式（1）计算。
X=(c_i×v)/M×f… (1)
式中：
X—试样中被测组分的含量，单位为微克每千克（ug/kg）；
Ci —从标准工作曲线上得到的被测组分溶液浓度,单位为微克每升（ug/L）；
V—样液最终定容体积，单位为毫升（mL）；
M—样液所代表的试样质量单位为克（g）;
f—稀释倍数。
计算结果保留2位有效数字。
（九）精密度
在重复性条件下，2次独立测定结果的绝对差不大于重复性限（r），在再现性条件下，2次独立测定结果的绝对差不大于再现性限（R）。方法定量限、回收率、被测组分的添加水平和回收率数据详细数据见检测方法附录部分。
（十）检出限、定量限和回收率
当取样量为5 g，按照试验方法操作并定容时，吲哚乙酸和吲哚丁酸的检出限均为5 μg/kg，定量限均为10 μg/kg。
通过参考国内标准《BJS 201703 豆芽中植物生长调节剂的测定》、地方标准《人参中吲哚乙酸和吲哚丁酸的测定 液相色谱-质谱/质谱法》中关于生长调节剂的定量限信息，并通过空白基质定量加标的方法，进行定量限和检出限的确证。试验表明，吲哚乙酸和吲哚丁酸在5ug/kg水平浓度时，目标化合物响应为5-8倍噪声；在10ug/kg水平浓度时，目标化合物响应为20-30倍噪声，符合色谱方法制定中的相关规定。综合考虑，制定本标准的检出限为5ug/kg，定量限为10ug/kg。
适用范围
是否包含专利
否
