主要技术内容
1 范围
本文件规定了牙鲆弹状病毒抗体间接ELISA检测法的缩略语、试剂和材料、仪器设备、样品的采集、保存与运输、检测和结果判定。
本文件适用于牙鲆弹状病毒抗体检测，牙鲆弹状病毒病的诊断、流行病学调查和分析，以及牙鲆弹状病毒疫苗免疫接种效果的评价。
2 规范性引用文件
下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB 19489 实验室生物安全通用要求
SC/T 7103 水生动物产地检疫采样技术规范
3 术语和定义
下列术语和定义适用于本文件。
3.1 牙鲆弹状病毒抗体 antibodies against hirame novirhabdovirus
牙鲆被HIRRV感染或疫苗接种后，鱼体产生免疫应答并分泌的特异性抗体，其具有中和HIRRV、激活补体系统及介导凝集反应等生物学功能。该抗体是免疫球蛋白，核心结构是“Y”形单体，由两条重链和两条轻链组成。
4 缩略语
下列缩略语适用于本文件。
AP：碱性磷酸酶（Alkaline phosphatase）
ELISA：酶联免疫吸附试验（Enzyme-linked immunosorbent assay）
G 蛋白：糖蛋白（Glycoprotein）
HIRRV：牙鲆弹状病毒（Hirame novirhabdovirus）
OD：光密度（Optical density）
pNPP-Na：对硝基苯磷酸二钠六水合物（4-Nitrophenyl phosphate disodium salt hexahydrate）
5 试剂和材料
本文件中所有化学试剂，除非另有规定，仅使用分析纯试剂。
5.1 包被液：配制见A.1。
5.2 洗涤液：配制见A.2。
5.3 封闭液：配制见A.3。
5.4 底物显色液（pNPP-Na）：配制见A.4。
5.5 终止液：配制见A.5。
5.6 HIRRV重组G蛋白：制备见附录B，每一批次的样品均需验证其免疫原性。
5.7 鼠抗牙鲆IgM单克隆抗体：商品化的鼠抗牙鲆IgM单克隆抗体，工作浓度具体数值按照产品说明书中间接ELISA方法的稀释度。
5.8 酶标抗体：商品化的AP标记的羊抗鼠IgG，工作浓度具体数值按照产品说明书中间接ELISA方法的稀释度。
5.9 阳性血清：制备见C.3。
5.10 阴性血清：制备见C.4。
6 仪器设备
6.1 恒温培养箱（37 ℃±1 ℃）
6.2 酶联免疫检测仪（具有405 nm波长检测功能）
6.3 高速冷冻离心机（速度范围100 g~12000 g)
6.4 移液器（200 μL、1000 μL）
6.5 多通道移液器（量程：20 μL~200 μL）
7 样品的采集、保存与运输
7.1 样品采集
按照SC/T 7103的规定采集。采用一次性注射器从牙鲆尾静脉采血，每尾鱼采血量50 μL~500 μL，室温静置2 h。血液凝固后取上清于4 ℃ 3000 g离心10 min，离心后取上清液移置新的离心管，再于4 ℃ 12000 g离心10 min，吸取上清液作为待测血清。
7.2 样品保存与运输
血清置于-80 ℃条件下贮存，当日使用的血清置于4 ℃条件下备用。避免反复冻融，血清冻融最多3次；运输时需全程低温。样品采集、保存与运输全过程符合GB 19489要求。
8 检测
8.1 以纯化的重组G蛋白作为包被抗原，将重组G蛋白用包被液（5.1）稀释至2 μg/mL，96孔酶标板每孔加入100 μL（每孔抗原包被量为200 ng），每个样品/对照设3孔重复，4 ℃包被12 h。
8.2 弃去孔中液体，每孔加入约300 μL洗涤液（5.2），室温静置5 min，洗3次，每次洗涤后弃去孔内液体并在吸水纸上拍干，但注意防止孔壁变干。
8.3 将封闭液（5.3）加入上述96孔酶标板，每孔200 μL，37 ℃封闭1 h。
8.4 洗涤同8.2。
8.5 将待检测血清、阳性血清及阴性血清用包被液（5.1）分别进行1:50稀释，加入上述96孔酶标板对应的待检样品孔、阳性对照孔、阴性对照孔，每孔100 μL，3个重复，37 ℃避光孵育1 h。当待检血清样品数量较多时，应提前进行样品稀释并同时加样，确保所有待检样品的反应时间准确、一致。
8.6 洗涤同8.2。
8.7 将鼠抗牙鲆IgM单克隆抗体用包被液（5.1）稀释至工作浓度，加入上述96孔酶标板，每孔加入100 μL，37 ℃避光孵育1 h。
8.8 洗涤同8.2。
8.9 将酶标抗体用包被液（5.1）稀释至工作浓度，加入上述96孔酶标板，每孔加入100 μL，37 ℃避
光孵育1 h。
8.10 洗涤同8.2。
8.11 将底物显色液（5.4）加入上述96孔酶标板，每孔100 μL，室温（20 ℃~25 ℃）避光显色30 min。
8.12 将终止液（5.5）加入上述96孔酶标板，每孔50 μL，终止反应。
8.13 上述酶标板放入酶联免疫检测仪，于405 nm波长处读取OD值（OD405），10 min之内完成。
9 结果判定
9.1 结果计算
计算检测样品的平均OD405、阳性对照血清平均OD405和阴性对照血清平均OD405。
9.2 结果判定
9.2.1 当阳性对照血清平均OD405≥0.5，阴性对照血清平均OD405≤0.1，结果成立。若不成立，需重新试验并记录异常原因。
9.2.2 计算检测样品的平均OD405（P）和阴性对照平均OD405（N）之比，当该比值大于等于2.1（P/N≥2.1）时，判定为牙鲆弹状病毒抗体阳性；当该比值小于2.1（P/N＜2.1）时，判定为牙鲆弹状病毒抗体阴性。
适用范围
本文件适用于牙鲆弹状病毒抗体检测，牙鲆弹状病毒病的诊断、流行病学调查和分析，以及牙鲆弹状病毒疫苗免疫接种效果的评价。
是否包含专利
否
